چگونه از اکسیداسیون در طول الکتروفورز جلوگیری کنیم؟

استراتژی های جامع برای جلوگیری از اکسیداسیون در طول الکتروفورز

I. مروری بر اکسیداسیون الکتروفورتیک

الکتروفورز به عنوان یک تکنیک جداسازی و تجزیه و تحلیل مهم، کاربردهای گسترده ای در بیوشیمی، زیست شناسی مولکولی و علم مواد دارد. با این حال، اکسیداسیون در طول الکتروفورز اغلب بر کیفیت و تکرارپذیری نتایج تجربی تأثیر می گذارد. واکنش های اکسیداسیون می تواند منجر به تخریب نمونه، اصلاح پروتئین، شکستن اسید نوکلئیک و تار شدن نوارهای الکتروفورتیک شود که به شدت بر دقت نتایج تحلیلی تأثیر می گذارد.

اکسیداسیون الکتروفورتیک عمدتاً از منابع زیر سرچشمه می گیرد: 1) گونه های اکسیژن فعال تولید شده در طول الکترولیز آب. 2) رادیکال های آزاد تولید شده توسط واکنش های الکترود. 3) اکسیژن محلول در محیط؛ و 4) اکسیداسیون خودکار برخی اجزای بافر. این عوامل اکسید کننده با گروه های حساس در نمونه (مانند گروه های تیول در پروتئین ها و بازها در اسیدهای نوکلئیک) واکنش داده و حالت اولیه نمونه را تغییر می دهند.

II. بهینه سازی سیستم های بافر

سیستم های بافر جزء اصلی سیستم الکتروفورز هستند و انتخاب و آماده سازی آنها مستقیماً بر درجه اکسیداسیون تأثیر می گذارد. سیستم بافر تریس{1}}گلیسین معمولاً در SDS-PAGE استفاده می‌شود، اما می‌تواند تغییرات قابل توجهی در pH و محصولات اکسیداسیون را در طول الکتروفورز طولانی‌مدت ایجاد کند. بهبودهای زیر را می توان در نظر گرفت:

1. از بافر آنتی اکسیدانی استفاده کنید: افزودن یک عامل کاهنده مانند DTT (دی تیوتریتول) یا -مرکاپتواتانول (غلظت نهایی 1-5 میلی‌مولار) به بافر می‌تواند به طور موثری از گروه‌های سولفیدریل آزاد در پروتئین‌ها در برابر اکسیداسیون محافظت کند. برای الکتروفورز اسید نوکلئیک، EDTA (1-5 میلی مولار) را می توان به یون های فلزی کلات اضافه کرد و واکنش های اکسیداسیون کاتالیز شده با فلز را کاهش داد.

2. یک سیستم بافر پایدارتر انتخاب کنید: بافرهای Bis{1} یا HEPES پایدارتر از Tris هستند، رانش pH کمتری را نشان می‌دهند و گونه‌های اکسیژن فعال کمتری تولید می‌کنند. برای الکتروفورز فوکوس ایزوالکتریک، هنگام استفاده از الکترولیت های آمفوتریک، باید قابلیت اکسید شدن آنها را در نظر گرفت و آنتی اکسیدان های مناسب را می توان اضافه کرد.

3. بافرها را تازه آماده کنید: از استفاده از بافرهایی که برای مدت طولانی نگهداری شده اند خودداری کنید، به ویژه آنهایی که حاوی اجزای به راحتی اکسید شده (مانند SDS) هستند. توصیه می شود بلافاصله تهیه و مصرف شود و یا به مقدار 20- درجه نگهداری شود.

4. pH بافر را کنترل کنید: بافر را در محدوده pH مناسب (pH 6-9) حفظ کنید. سطوح pH بیش از حد بالا یا پایین می تواند واکنش های اکسیداسیون خاصی را تسریع کند. از pH متر برای کالیبراسیون دقیق استفاده کنید و از تکیه صرفاً به نوارهای آزمایش pH اجتناب کنید.

III. کنترل دقیق شرایط الکتروفورز

بهینه سازی پارامترهای الکتروفورز برای کاهش اکسیداسیون بسیار مهم است و نیاز به کنترل چندین جنبه از جمله ولتاژ، جریان و دما دارد:

1. کنترل ولتاژ و جریان: استفاده از حالت ولتاژ ثابت به جای حالت جریان ثابت، واکنش های الکترولیتی را کاهش می دهد. به طور کلی، ولتاژ الکتروفورز پروتئین در 100-150 ولت و الکتروفورز اسید نوکلئیک در 50-100 ولت کنترل می شود. ولتاژ بالا محصولات الکترولیتی و گرمای بیشتری تولید می کند و اکسیداسیون را تشدید می کند.

2. مدیریت دما: گرمایش ژول که در طول الکتروفورز ایجاد می شود، واکنش های اکسیداسیون را تسریع می کند. می توان از سیستم خنک کننده آب در گردش یا قرار دادن دستگاه الکتروفورز در محیط 4 درجه استفاده کرد. ژل های پیش ساخته نسبت به ژل های خانگی اتلاف حرارت بهتر و دمای پایدارتری دارند.

3. بهینه سازی زمان الکتروفورز: زمان الکتروفورز را به حداقل برسانید و در عین حال از کارایی جداسازی اطمینان حاصل کنید. زمان را می توان از طریق آزمایش های اولیه تعیین کرد تا از دوره های طولانی الکتروفورز غیر ضروری جلوگیری شود.

4. حفاظت از الکترود: الکترودهای پلاتین پایدارتر از الکترودهای کربن یا فولاد ضد زنگ هستند و محصولات جانبی واکنش الکترود را کاهش می دهند. الکترودها را به طور مرتب تمیز کنید تا از تجمع محصولات اکسیداسیون جلوگیری شود. IV. نمونه برداری و اقدامات حفاظتی

جابجایی و حفاظت نمونه اولین خط دفاعی در برابر اکسیداسیون است:

1. آماده سازی نمونه: برای کاهش کامل پیوندهای دی سولفید پروتئین، ماده احیا کننده کافی (مثلاً 5{5}}10 میلی مولار DTT یا 5٪ - مرکاپتواتانول) را به بافر لیز اضافه کنید. برای نمونه های حساس، پردازش می تواند تحت حفاظت نیتروژن انجام شود.

2. نگهداری نمونه: پس از جداسازی، در -80 درجه نگهداری کنید، از چرخه‌های ذوب مکرر انجماد- جلوگیری کنید. افزودن گلیسرول (غلظت نهایی 10-20%) می تواند آسیب یخ زدگی و اکسیداسیون را کاهش دهد.

3. تکنیک های بارگذاری نمونه: نمونه ها را در سریع ترین زمان ممکن بارگیری کنید تا زمان قرار گرفتن در معرض در مخزن الکتروفورز به حداقل برسد. برای جداسازی نمونه از هوا می توان از یک لایه پوششی (مثلاً روغن معدنی) استفاده کرد.

4. حفاظت ویژه: برای نمونه های با قابلیت اکسیداسیون بالا (به عنوان مثال، آنزیم های خاص یا فاکتورهای رونویسی)، جاذب کننده های رادیکال آزاد مانند اسید اسکوربیک (1-5 میلی مولار) یا تیوریا (1-3 میلی مولار) را می توان به بافر الکتروفورز اضافه کرد.

V. محیط زیست و بهینه سازی تجهیزات

1. حفاظت از گاز بی اثر: وصل کردن نیتروژن یا آرگون به مخزن الکتروفورز برای جایگزینی هوا می تواند به طور قابل توجهی اکسیداسیون را کاهش دهد. یک روش ساده پوشاندن سطح بافر الکتروفورز با لایه ای از گاز بی اثر است.

2. نور{1}}عملیات اثبات: برخی از واکنش های اکسیداسیون فوتوکاتالیز می شوند. از قرار گرفتن مستقیم در معرض نور قوی در دستگاه الکتروفورز باید اجتناب شود. می توان از فویل آلومینیومی برای بسته بندی دستگاه استفاده کرد یا مخزن الکتروفورز را می توان مات نگه داشت.

3. تعمیر و نگهداری تجهیزات: به طور مرتب اتصالات الکترود و سیم کشی دستگاه الکتروفورز را برای اطمینان از تماس خوب و کاهش الکترولیز غیرعادی بررسی کنید. مخزن الکتروفورز را برای حذف محصولات اکسیداسیون انباشته تمیز کنید.

4. پردازش الکتروفورز پس از{1}: پیشگیری از اکسیداسیون نیز در مراحل انتقال یا رنگ‌آمیزی بسیار مهم است. یک عامل کاهنده را می توان به بافر انتقال اضافه کرد و باید از قرار گرفتن طولانی مدت در معرض هوا در طول رنگ آمیزی اجتناب شود.

VI. استراتژی های پیشگیری از اکسیداسیون برای تکنیک های خاص الکتروفورز

1.-الکتروفورز دو بعدی: اکسیداسیون در مرحله فوکوس ایزوالکتریک بسیار محتمل است. تی اوره (2M) و یک عامل کاهنده را می توان به نمونه و محلول پوششی اضافه کرد. فرآیند تمرکز باید تحت حفاظت نیتروژن انجام شود.

2. الکتروفورز غیر دناتوره‌کننده: حفظ حالت طبیعی پروتئین‌ها نیازمند محافظت قوی در برابر اکسیداسیون است. از عوامل اکسید کننده قوی در محلول بافر اجتناب کنید. گلیسرول (10-20٪) را می توان برای تثبیت ترکیب پروتئین اضافه کرد.

3. الکتروفورز RNA: RNA بسیار مستعد تخریب و اکسیداسیون است. همه محلول ها باید با آب تصفیه شده با DEPC- تهیه شوند. از دستگاه الکتروفورز اختصاصی استفاده کنید و RNase را به شدت حذف کنید. مهارکننده های RNase را به محلول بافر اضافه کنید.

4. الکتروفورز مویرگی: به دلیل کوچک بودن مویرگ ها، اثر اکسیداسیون بیشتر است. از مویرگ های پوشش داده شده می توان برای کاهش جذب و اکسیداسیون استفاده کرد. محلول بافر باید به شدت گاز زدایی شود.

VII. مشکلات و راه حل های رایج

1. نوارهای پروتئینی تار یا دنباله دار: این ممکن است به دلیل اکسیداسیون باشد که باعث تجمع یا تخریب پروتئین می شود. بررسی کنید که آیا عامل کاهنده ناکارآمد است، آیا محلول بافر تازه است و آیا دمای الکتروفورز خیلی بالا است.

2. نوارهای الکتروفورز اسید نوکلئیک نامشخص: ممکن است به دلیل شکستگی اکسیداسیون باشد. مطمئن شوید که از EDTA استفاده شده است، PH بافر صحیح است و زمان الکتروفورز خیلی طولانی نیست.

3. سیگنال ضعیف وسترن بلات: اکسیداسیون ممکن است باعث آسیب به اپی توپ های آنتی ژن شود. شرایط پردازش و انتقال نمونه را بهینه کنید و عامل کاهنده کافی اضافه کنید. 4. حاشیه های متمرکز ایزوالکتریک غیرعادی: اکسیداسیون باعث ناپایداری در الکترولیت آمفوتریک می شود. زمان و ولتاژ فوکوس را بررسی کنید و محافظ گاز بی اثر را در نظر بگیرید.

با بکارگیری جامع استراتژی های فوق، اکسیداسیون در حین الکتروفورز را می توان به طور موثر کنترل کرد و در نتیجه نتایج آزمایشی قابل اعتمادتر و قابل تکرارتری حاصل شد. سیستم های آزمایشی مختلف ممکن است به بهینه سازی هدفمند نیاز داشته باشند. توصیه می شود که یک طرح ضد اکسیداسیون مناسب از طریق آزمایش های اولیه تعیین شود.